初級檢驗(yàn)技士輔導(dǎo):細(xì)菌的代謝試驗(yàn)
初級檢驗(yàn)技士輔導(dǎo):細(xì)菌的代謝試驗(yàn)
細(xì)菌對于碳水化合物的代謝試驗(yàn)原理為:由于細(xì)菌各自具有不同的酶系統(tǒng),對糖的分解能力不同,有的能分解某些糖產(chǎn)生酸和氣體,有的雖能分解糖產(chǎn)生酸,但不產(chǎn)生氣體,有的則不分解糖。據(jù)此可對分解產(chǎn)物進(jìn)行檢測從而鑒別細(xì)菌。具體試驗(yàn)方法有:①糖類發(fā)酵試驗(yàn)是鑒定細(xì)菌最常用的生化反應(yīng),特別是對腸桿菌的鑒定尤為重要;②葡萄糖代謝類型鑒別試驗(yàn);③七葉苷水解試驗(yàn);④淀粉水解試驗(yàn);⑤甲基紅試驗(yàn);⑥V-P試驗(yàn);⑦β-半乳糖苷酶試驗(yàn)(ONPG試驗(yàn))。
1.糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗(yàn)
(1)原理:由于各種細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖(醇、苷)類的酶,故分解糖類的能力各不相同,有的能分解多種糖類,有的僅能分解1~2種糖類,還有的不能分解。細(xì)菌分解糖類后的終末產(chǎn)物亦不一致,有的產(chǎn)酸、產(chǎn)氣,有的僅產(chǎn)酸,故可利用此特點(diǎn)以鑒別細(xì)菌。
(2)培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基中加入0.5%~1%的糖類(單糖、雙糖或多糖)、醇類(甘露醇、肌醇等)、苷類(水楊苷等)。培養(yǎng)基可為液體、半固體、固體或微量生化管幾種類型。
(3)方法:將分離的純種細(xì)菌,以無菌操作接種到糖(醇、苷)類發(fā)酵培養(yǎng)基中,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至兩周后,觀察結(jié)果。若用微量發(fā)酵管,或要求培養(yǎng)時(shí)間較長時(shí),應(yīng)保持濕度,以免培養(yǎng)基干燥。
(4)結(jié)果:接種的細(xì)菌,若能分解培養(yǎng)基中的糖(醇、苷)類產(chǎn)酸時(shí),培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)。若產(chǎn)氣可使液體培養(yǎng)基中倒管內(nèi)或半固體培養(yǎng)基內(nèi)出現(xiàn)氣泡,固體培養(yǎng)基內(nèi)有裂隙等現(xiàn)象。若不分解,培養(yǎng)基中除有細(xì)菌生長外,無任何其他變化。
(5)應(yīng)用:是鑒定細(xì)菌最主要和最基本的試驗(yàn),特別對腸桿菌科細(xì)菌的鑒定尤為重要。
2.氧化-發(fā)酵試驗(yàn)(O/F試驗(yàn))
(1)原理:細(xì)菌在分解葡萄糖的過程中,必須有分子氧參加的,稱為氧化型。氧化型細(xì)菌在無氧環(huán)境中不能分解葡萄糖。細(xì)菌在分解葡萄糖的過程中,可以進(jìn)行無氧降解的,稱為發(fā)酵型。發(fā)酵型細(xì)菌無論在有氧或無氧的環(huán)境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的細(xì)菌稱為產(chǎn)堿型。利用此試驗(yàn)可區(qū)分細(xì)菌的代謝類型。
(2)培養(yǎng)基:Hugh-Leifson培養(yǎng)基。
(3)方法:將待檢菌同時(shí)穿刺接種兩支HL培養(yǎng)基,其中一支培養(yǎng)基滴加無菌的液體石蠟(或其他礦物油),高度不少于1cm.將培養(yǎng)基于35℃培養(yǎng)48h或更長。
(4)結(jié)果:兩支培養(yǎng)基均無變化為產(chǎn)堿型或不分解糖型;兩支培養(yǎng)基均產(chǎn)酸為發(fā)酵型;若僅不加石蠟的培養(yǎng)基產(chǎn)酸為氧化型。
(5)應(yīng)用:主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵菌的鑒別,前者均為發(fā)酵型,而后者通常為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌間的鑒別。
3.β-半乳糖苷酶試驗(yàn)(ONPG試驗(yàn))
(1)原理:有的細(xì)菌可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶,能分解鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG),而生成黃色的鄰-硝基酚,在很低濃度下也可檢出。
(2)試劑:0.75M ONPG溶液:取80mg溶于15ml蒸餾水中,在加入緩沖液(6.9g NaH2P04溶于45ml蒸餾水中,用30% NaOH調(diào)整pH為7.0,再加水至50ml)5ml,置4℃冰箱中保存。0NPG溶液為無色,如出現(xiàn)黃色,則不應(yīng)再用。
(3)方法:從克氏雙糖鐵培養(yǎng)基上取菌,于0.25ml無菌生理鹽水中制成菌懸液,加入一滴甲苯并充分振搖,使酶釋放。將試管置37℃水浴5min,加入0.25ml ONPG試劑,水浴20min~3h觀察結(jié)果。
(4)結(jié)果:菌懸液呈現(xiàn)黃色為陽性反應(yīng),一般在20~30min內(nèi)顯色。
(5)應(yīng)用:迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌ONPG試驗(yàn)為陽性,而不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。本實(shí)驗(yàn)主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。
4.七葉苷水解試驗(yàn)
(1)原理:有的細(xì)菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素,七葉素與培養(yǎng)基中枸櫞酸鐵的二價(jià)鐵離于反應(yīng),生成黑色的化合物,使培養(yǎng)基呈黑色。
(2)培養(yǎng)基:七葉苷培養(yǎng)基、膽汁七葉苷培養(yǎng)基。
(3)方法:將待檢菌接種于七葉苷培養(yǎng)基中,培養(yǎng)后觀察結(jié)果。
(4)結(jié)果:培養(yǎng)基變?yōu)楹谏珵殛栃?,不變色者為陰性?/p>
(5)應(yīng)用:主要用于D群鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別,前者陽性,后者陰性。也可用于革蘭陰性桿菌及厭氧菌的鑒別。
5.甲基紅試驗(yàn)
(1)原理:某些細(xì)菌在糖代謝過程中,分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸可進(jìn)一步分解,產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等,使培養(yǎng)基的pH降至4.5以下,當(dāng)加入甲基紅試劑則呈紅色,為甲基紅試驗(yàn)陽性。若細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少,或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)(如醇、酮、醚、氣體和水等),則培養(yǎng)基的酸度仍在pH6.2以上,故加入甲基紅指示劑呈黃色,是為陰性。
(2)培養(yǎng)基:葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。
(3)方法:將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中,培養(yǎng)2~4d,于培養(yǎng)基內(nèi)加入甲基紅試劑,立即觀察結(jié)果?! ?4)結(jié)果:呈現(xiàn)紅色為陽性;橘紅色為弱陽性;黃色為陰性。
(5)應(yīng)用:主要用于鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌,前者為陽性,后者為陰性。此外腸桿菌科中沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬等為陽性,而腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬則為陰性。
6.V-P試驗(yàn)
(1)原理:某些細(xì)菌在糖代謝過程中,分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中,被空氣中的氧氧化為二乙酰,進(jìn)而與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用,生成紅色化合物,則為V-P試驗(yàn)陽性。若培養(yǎng)基中胍基含量較少,則可加入少量含胍基化合物,如肌酸或肌酐等。試驗(yàn)時(shí)加入a-萘酚可加速此反應(yīng)。
(2)培養(yǎng)基:葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。
(3)方法:將待檢菌接種于上述培養(yǎng)基中,于35℃培養(yǎng)48h后加入甲液(6% α-萘酚酒精溶液)和乙液(40% KOH溶液),振搖。
(4)結(jié)果:在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性;如無紅色出現(xiàn)且于35℃4h后仍如故者即為陰性。
(5)應(yīng)用:本試驗(yàn)常與甲基紅試驗(yàn)一起使用,因?yàn)榍罢哧栃缘募?xì)菌,后者通常為陰性。
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