分子生物學(xué)筆記 第八章 基因克隆

第一節(jié) 重組DNA中常用的工具酶 包括限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等，一、限制性內(nèi)切酶的定義、命名和分類限制性核酸內(nèi)切酶是識別并 切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。限制性核酸內(nèi)切酶的來源：細(xì)菌的限制－修飾系統(tǒng)。分子克隆中所用的限制性核酸內(nèi)切酶 屬于第Ⅱ類。限制性核酸內(nèi)切酶的命名。二、限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點(diǎn) 1、識別位點(diǎn)的DNA序列呈二重旋轉(zhuǎn)對稱（即具有迥文結(jié)構(gòu)）； 2、切割DNA均產(chǎn)生含5’-磷酸和3’-羥基的末端； 3、 錯位切割產(chǎn)生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿對稱軸切割雙鏈DNA產(chǎn)生平頭末端，也稱鈍性末端。 4、少數(shù)不同的限制酶可識別和切割相同的位點(diǎn)，這些酶稱為同切酶，如MboI Ⅰ和 Sau3A。三、其它工具酶參考“分子克隆”（Sambrook,J et al . molecular cloning）

第二節(jié) 載體－宿主系統(tǒng) 一、概述載體(vector)是攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的DNA,它們一般是通過改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu) 建的。載體應(yīng)具備以下條件：１、 能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中復(fù)制；２、 具有多種限制酶的單一切點(diǎn)（即所謂多克隆位點(diǎn)）以便外源DNA插入；３、 具有篩選標(biāo)志以區(qū)別陽性與陰性重組分子；４、 載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體DNA與宿主DNA便于分離；５、 對于表達(dá)型載體還應(yīng)具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動子、增強(qiáng)子、加尾信號等基因表達(dá)元件。宿主細(xì)胞是基因克隆中重組DNA分子的繁殖 場所，適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，必須符以下條件：１、 對載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒有嚴(yán)格的限制；２、 不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA；３、 在重組DNA增殖過程中，不會對它進(jìn)行修飾；４、 重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組；５、 容易導(dǎo)入重組DNA分子；６、 符合重組DNA操作的安全標(biāo)準(zhǔn)。二、質(zhì)粒載體質(zhì)粒(plasmid)是存在于細(xì)菌染色體外的小的共價、閉環(huán)雙鏈DNA分子，能自 主復(fù)制，并在細(xì)胞分裂時遺傳給子代細(xì)胞。質(zhì)粒可賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀如抗藥性等，通過質(zhì)粒賦予細(xì)菌的表型可識別質(zhì)粒的存在， 這是篩選重組轉(zhuǎn)化子的基礎(chǔ)。作為載體的質(zhì)粒一般具有以下特點(diǎn)：１、 分子相對較?。ǎ场祝保発b）；２、 松馳型復(fù)制；３、 具有適當(dāng)?shù)亩嗫寺∥稽c(diǎn)以便外源DNA插入；４、 具有插入失活篩選標(biāo)志，便于從平板上直接篩選陽性重組子；５、 質(zhì)粒能攜帶的外源DNA片段一般較小（<15kb）．三、λ噬菌體載體 λ噬菌體是一種雙鏈DNA噬菌體，基因組約為50kb+。線性λ噬菌體DNA分子的兩端各有12堿基的互補(bǔ)單鏈序列，是天然的粘 性末端，稱為COS位點(diǎn)。 λ噬菌體的生活周期：溶菌（裂解）生長時在平皿上形成清亮的噬菌斑；溶源性生長。 λ噬菌體的基因組：左臂長約20kb,含噬菌體頭、尾蛋白編碼基因；中央片段長約12-24kb,對噬菌體為非必需區(qū)；右臂長約 10kb,含λ噬菌體復(fù)制和溶菌相關(guān)蛋白的編碼基因。所有λ噬菌體載體均為通過切除非必需的中央?yún)^(qū)，并增減某些限制性酶切位點(diǎn)和 插入適當(dāng)?shù)暮Y選標(biāo)記基因改造而成。已構(gòu)建的λ噬菌體載體分為兩類：１、置換型載體：有兩個酶切位點(diǎn)或兩組排列相反的多克隆位點(diǎn)， 其間的DNA片段可被外源DNA置換。這類載體適于克隆5-20kb的外源基因片段，常用于構(gòu)建基因組DNA文庫。２、插入型載 體：只有一個限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或一組多克隆位點(diǎn)可供外源基因插入。這類載體允許插入5-7kb的外源DNA,適于構(gòu)建cDNA文 庫。如λgt 噬菌體載體。一般將噬菌體DNA在體外包裝成病毒顆粒后再用于感染受體菌，這樣能大大提高轉(zhuǎn)染效率。四、Ｍ13絲狀噬菌體載體Ｍ 13基因組大小為6407bp，它是一種閉環(huán)的單鏈DNA分子，在感染細(xì)菌后呈雙鏈復(fù)制型DNA。因此用作克隆載體的雙鏈DNA 可從細(xì)菌中分離得到。在細(xì)菌中，雙鏈DNA復(fù)制100-200拷貝后就大量產(chǎn)生單鏈DNA,后者包裝成子代噬菌體顆粒，分泌到細(xì) 胞外，而不裂解細(xì)菌。在M13基因組中含507個核苷酸的非必需區(qū)，在這個區(qū)域插入外源DNA不會影響M13的繁殖和生存，現(xiàn)在 使用的M13載體如M13Mp18等均為對此區(qū)域進(jìn)行改造而獲得。 M13克隆的最大問題是不能插入較大的外源ＤＮＡ片段（一般<1000bp）,但M13載體的優(yōu)點(diǎn)是從細(xì)菌中釋放出來的噬 菌體顆粒中含有一條與克隆的模板DNA互補(bǔ)的單鏈，所以最適合于制備DNA測序時用的單鏈模板，另外也可用于制備單鏈特異性DN A探針。五、粘粒載體 粘粒（柯斯質(zhì)粒）是指含有λ噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒，由λDNA的COS區(qū)(約20-數(shù)百bp)與質(zhì)粒重組而成，在宿主細(xì)胞中 可作為正常噬菌體進(jìn)行復(fù)制，但不表達(dá)任何噬菌體的功能。粘粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：１、 含有抗藥性標(biāo)記和質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)；２、 一個或多個單一限制酶切位點(diǎn)；３、 帶有λ噬菌體粘性末端；４、 分子?。?-6kb）,可容納大到40-50kb的外源DNA片段，因此適于構(gòu)建真核生物基因組DNA文庫。六、酵母人工染色體 載體酵母人工染色體由酵母染色體的著絲粒(cen4)、自主復(fù)制序列(ARS1)和來自四膜蟲的端粒(Tel)等功能性DNA序 列組成。它可攜帶長達(dá)200-1000kb的DNA片段，因此在人基因組DNA大片段的克隆中非常有用，是染色體克隆排序的主要 工具。用酵母人工染色體克隆DNA的過程與λ噬菌體相似，將DNA大片段與載體的兩臂相聯(lián)，然后將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母細(xì)胞中， 利用載體上的選擇性標(biāo)記進(jìn)行篩選。

第三節(jié) 目的基因的獲取 一、通過建立基因文庫分離靶基因基因文庫包括兩類：基因組文庫和cDNA文庫，兩種文庫的建庫過程不同，產(chǎn)生的基因結(jié)構(gòu)也不同， 因此應(yīng)用范圍也不相同。（一）、基因組文庫是含有某種生物體（或組織、細(xì)胞）全部基因的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體。用λ噬菌 體載體構(gòu)建基因組文庫的基本步驟：１、 準(zhǔn)備載體DNA(如置換型λ噬菌體載體)，用適當(dāng)?shù)南拗泼赶⒎蛛x得到載體的左右兩臂；２、 純化真核細(xì)胞高分子量DNA，并用適當(dāng)?shù)南拗泼覆糠窒?；３?分離適當(dāng)大小的基因組DNA片段（20-24kb）；４、 連接載體與外源ＤＮＡ；５、 連接產(chǎn)物體外包裝及感染；６、 基因組文庫的擴(kuò)增。由于基因組文庫包含了染色體的所有隨機(jī)片段形成的重組DNA克隆，因此，利用適當(dāng)?shù)暮Y選方法，就可以從中找出 攜帶所需目的基因片段的重組克隆。（二）、cDNA文庫 cDNA是指以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補(bǔ)DNA. 以細(xì)胞的全部mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA組成的重組克隆群體稱為cDNA文庫。從cDNA文庫可以獲得較完整的連續(xù)編碼序列（ 不含內(nèi)含子），便于表達(dá)成蛋白質(zhì)。構(gòu)建cDNA文庫的主要步驟：１、 mRNA分離；２、 cDNA第一鏈合成；３、 cDNA第二鏈合成；４、 載體與cDNA的連接; ５、 噬菌體的包裝及轉(zhuǎn)染；６、 cDNA文庫的擴(kuò)增和保存。二、化學(xué)合成法制備DNA片段主要用于一些小的DNA 片段的合成。三、聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增基因片段對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)（ＰＣＲ），以基因組D NA或cDNA模板擴(kuò)增得到目的基因片段。

 第四節(jié) DNA分子的體外連接 DNA片段的體外連接是重組DNA技術(shù)的關(guān)鍵。DNA連接是由DNA連接酶催化完成的。一、DNA連接酶 DNA連接酶催化兩年雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的的DNA連接酶是來自 Ｔ４噬菌體的DNA 連接酶：T4 DNA連接酶，該酶需要ATP作為輔助因子。 T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于：１、 連接具有同源互補(bǔ)粘性末端的ＤＮＡ片段；２、 連接雙鏈DNA分子間的平端；３、 在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。二、粘性末端連接如果載體和插入片段具有相同的粘性末端，則很容易用DN A連接酶連接成環(huán)狀的重組DNA分子，但是要注意當(dāng)載體和插入的兩個末端均為同源的粘性末端時，連接后可能出現(xiàn)以下問題：１、 載體自身環(huán)化，造成假陽性背景克隆，為避免此問題，可在連接前，用堿性磷酸酶將載體DNA 5’- 端去磷酸化，這樣只有載體和插入片段之間才能發(fā)生連接；２、 插入片段可雙向插入；３、 插入片段可多拷貝插入。當(dāng)DNA片段兩端為非同源的粘性末端時，可實(shí)現(xiàn)定向克隆，這時的連接效率非常高，是重組方案中最有效、簡 捷的途徑。三、平端連接平端連接的優(yōu)點(diǎn)是可用T4連接酶連接任何DNA平端，這對不同DNA分子的連接十分有利。因?yàn)槌讼嗤?不同限制酶酶切產(chǎn)生的平末端分子外，含3’-或5’-突出的粘性末端也可以被補(bǔ)齊或削平，實(shí)現(xiàn)平端連接。（一）、5’-突出粘性 末端的補(bǔ)齊限制酶降解產(chǎn)生的5’-端突出的粘性末端，可用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段（klenow片段）補(bǔ)齊。（二）、3 ’-突出粘性末端的削平含3’- 突出的粘性末端可用T4 DNA聚合酶的3’→5’外切核酸酶活性補(bǔ)平。平端連接的主要問題是，它的連接效率比粘性末端低，因此需較多的T4 DNA連接酶和較高的底物濃度，聚乙二醇（ＰＥＧ）可促進(jìn)平端連接反應(yīng)。四、人工接頭連接對平端DNA片段，可借助人工合成的接 頭來方便連接。所謂接頭是人工合成的至少８個核苷酸長的一段迥文序列。接頭是平端，在磷酸化后通過T4 DNA連接酶可與大多數(shù)平端DNA連接。連接后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割，可產(chǎn)生所需要的粘性末端。五、利用適配子連接適配子是 人工合成的具有一個以上限制酶識別位點(diǎn)的短序列，它具有一個平端，可與其它DNA的平端連接，同時它還有某種限制酶的突出端，可 與含互補(bǔ)的限制酶突出端的DNA片段連接，連接后，用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钣挚僧a(chǎn)生所需要的突出粘端。

第五節(jié) 重組DNA導(dǎo)入宿主菌 體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達(dá)。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入 受體可有不同的方法。一、轉(zhuǎn)化 指以細(xì)菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)化時，細(xì)菌必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源DNA的狀 態(tài)，然后利用短暫熱休克使DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主中。此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細(xì)菌，它的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、適用于任何菌株 。二、轉(zhuǎn)染和感染利用噬菌體DNA作為載體時可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后 使其感染受體菌。另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進(jìn)受體菌。但習(xí)慣上常把 以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。 第六節(jié) 重組克隆的篩選與鑒定 基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。通過細(xì)菌培養(yǎng)以及重組子的擴(kuò)增，獲得 所需的基因片段的大量拷貝。進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能，或表達(dá)該基因的產(chǎn)物。一、抗藥性標(biāo)志的篩選如果克隆載體帶有某種抗藥 性標(biāo)志基因如ampr或tetrr ，轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開來。如果重 組DNA時將外源基因插入標(biāo)志基因內(nèi)，該標(biāo)志基因失活，通過有無抗菌素培養(yǎng)基對比培養(yǎng)，還可區(qū)分單純載體或重組載體（含外源基因 ）的轉(zhuǎn)化菌落。二、β－半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選很多載體都攜帶一段細(xì)菌的lacZ基因，它編碼β－半乳糖苷酶N-端的146個氨基酸 ，稱為α－肽，載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞為lacZΔ15基因型，它表達(dá)β－半乳糖苷酶的C-端肽鏈，當(dāng)載體與宿主細(xì)胞同時表達(dá)兩個片 段時，宿主細(xì)胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特異的底物X-gal 變?yōu)樘m色化合物，這就是所謂的α－互補(bǔ)，而重組子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互補(bǔ)，在含X-gal的平板上，含 陽性重組子的細(xì)菌為無色菌落或噬菌斑。三、菌落快速裂解鑒定法從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測載體質(zhì)粒大小，判斷有無 插入片段存在，該法適于插入片段較大的重組子初篩。四、內(nèi)切酶圖譜鑒定經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)粒 或重組噬菌體DNA,用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，釋放出插入片斷；對于可能存在雙向插入的重組子，還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入的方向。五 、通過聚合酶鏈反應(yīng)篩選重組子一些載體的外源DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)存在特定的序列，如啟動子序列等，利用這些特異性序列作為引物， 對小量制備的質(zhì)粒DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）分析，不但可迅速擴(kuò)增插入片斷，判斷是否陽性重組子，還可直接對插入進(jìn)行DN A 序列分析。六、菌落或噬菌斑原位雜交它是先將轉(zhuǎn)化菌落或噬菌斑直接鋪在硝酸纖維素膜或瓊脂平板上，再轉(zhuǎn)移至另一膜上，然后用標(biāo)記 的特異DNA探針進(jìn)行分子雜交，挑選陽性菌落。該法能進(jìn)行大規(guī)模操作，一次可篩選多達(dá)5x105-5x106個菌落或噬菌斑，特 別適于從基因文庫中挑選目的基因。