初級檢驗技士輔導(dǎo)：厭氧菌的分離與鑒定
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初級檢驗技士輔導(dǎo)：厭氧菌的分離與鑒定 $lesson$
厭氧菌的分離與鑒定
(一)直接鏡檢
根據(jù)形態(tài)和染色性，結(jié)合標(biāo)本形狀與氣味，臨床工作中可初步判斷標(biāo)本中可能有的細(xì)菌。
(二)分離培養(yǎng)
主要分初代培養(yǎng)和次代培養(yǎng)兩個階段，其中初代培養(yǎng)相對比較困難，關(guān)鍵在于厭氧環(huán)境和培養(yǎng)基的選擇。
初代培養(yǎng)的一般原則：
(1)先將標(biāo)本涂片染色直接鏡檢，指導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇。
(2)盡量選用在厭氧菌中覆蓋面寬的非選擇性培養(yǎng)基。
(3)最好多選1-2種覆蓋面不同的選擇性培養(yǎng)基。
(4)盡量保證培養(yǎng)基新鮮。
(5)要考慮到微需氧菌保存的可能。
1、選用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基接種：應(yīng)接種固體和液體培養(yǎng)基。
(1)培養(yǎng)基的使用：應(yīng)注意下列各點：
1)盡量使用新鮮培養(yǎng)基，2-4小時內(nèi)用完;
2)應(yīng)使用預(yù)還原培養(yǎng)基，預(yù)還原24-48小時更好。
3)可采用預(yù)還原滅菌法制作的培養(yǎng)基。
4)液體培養(yǎng)基應(yīng)煮沸10分鐘，以驅(qū)除溶解氧，并迅速冷卻，立即接種。
5)培養(yǎng)厭氧菌的培養(yǎng)基均應(yīng)營養(yǎng)豐富，并加有還原劑與生長刺激因子。
(2)培養(yǎng)基的選擇：初次培養(yǎng)一般都使用選擇培養(yǎng)基和非選擇培養(yǎng)基。
1)非選擇培養(yǎng)基：本培養(yǎng)基使分離的厭氧菌不被抑制，幾乎能培養(yǎng)出所有的厭氧菌。
2)選擇培養(yǎng)基：為有目的的選擇常見厭氧菌株，以便盡快確定厭氧的種類。
2、每份標(biāo)本至少接種3個血平板，分別置于有氧，無氧及5%-10%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，以便正確地培養(yǎng)出病原菌，從而判斷其為需氧菌、兼性厭氧菌、微需氧菌或厭氧菌中的哪一類。
3、厭氧培養(yǎng)法：
(1)厭氧罐培養(yǎng)法：在嚴(yán)密封閉的罐子里，應(yīng)用物理或化學(xué)的方法造成無氧環(huán)境進行厭氧培養(yǎng)。常用冷觸酶法、抽氣換氣法，剛末法和黃磷燃燒法。
(2)氣袋法：利用氣體發(fā)生器產(chǎn)生CO2和H2，H2在觸媒的作用下與罐內(nèi)的氧氣結(jié)合成水，從而造成無氧環(huán)境。
(3)氣體噴射法：本法是從培養(yǎng)基的制備到標(biāo)本的接種直至進行培養(yǎng)的全過程，均在CO2的不斷噴射下進行。本法的關(guān)鍵是必須有無氧CO2。
(4)厭氧手套箱培養(yǎng)法：是迄今厭氧培養(yǎng)的最佳儀器之一，該箱由手套操作箱與傳遞箱兩部分組成，前者還附有恒溫培養(yǎng)箱，通過厭氧手套箱可進行標(biāo)本接種、培養(yǎng)和鑒定等全過程。
(5)其他培養(yǎng)法：平板焦性沒食子酸法;生物耗氧法;高層瓊脂培養(yǎng)法。
4、厭氧狀態(tài)的指示：亞甲蘭和刃天青。
無氧時均呈白色，有氧時亞甲蘭呈藍色，刃天青呈粉紅色。
5、分離培養(yǎng)厭氧菌失敗的原因
1)培養(yǎng)前未做標(biāo)本的直接涂片和染色鏡檢;
2)標(biāo)本在空氣中放置太久或接種的操作時間過長;
3)未用新鮮配制的培養(yǎng)基;
4)未用選擇性培養(yǎng)基;
5)培養(yǎng)基未加必要的補充物質(zhì);
6)初代培養(yǎng)應(yīng)用了硫乙醇酸鈉;
7)無合適的厭氧罐或裝備出現(xiàn)漏氣等問題;
8)催化劑失活;
9)培養(yǎng)時間不足;
10)厭氧菌的鑒定材料有問題。
6、鑒定實驗：可根據(jù)厭氧菌的菌體形態(tài)、染色反應(yīng)、菌落性狀以及對某些抗生素的敏感性做出初步鑒定。最終鑒定則要進行生化反應(yīng)及終末代謝產(chǎn)物等項檢查。
(1)形態(tài)和染色：可為厭氧菌的鑒定提供參考依據(jù)。
(2)菌落性狀：不同的厭氧菌其菌落形態(tài)和性質(zhì)不同。梭菌的菌落特點是形態(tài)不規(guī)則，而無芽孢厭氧菌多呈單個的圓形小菌落。色素、溶血特點以及在紫外線下產(chǎn)生熒光的情況也可作為厭氧菌鑒定的參考依據(jù)。
1)色素：產(chǎn)黑色素類桿菌2~10天可產(chǎn)生黑色素;溶齒放線菌培養(yǎng)3~4天產(chǎn)生粉紅色色素。
2)溶血：產(chǎn)氣莢膜梭菌在新鮮的血瓊脂平板上可產(chǎn)生雙溶血環(huán)。
3)熒光：
(3)抗生素敏感實驗：常用的抗生素有卡那霉素及甲硝唑?？敲顾乜捎糜谒髼U菌屬與類桿菌屬的區(qū)分，甲硝唑用于厭氧菌與非厭氧菌的區(qū)分。
(4)生化特性：主要包括多種糖發(fā)酵試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、觸酶試驗、卵磷脂酶試驗、脂肪酸酶試驗、蛋白溶解試驗、明膠液化試驗、膽汁肉湯生長試驗及硫化氫試驗等。目前有多種商品化的鑒定系統(tǒng)可以使用。
(5)氣液相色譜：可以利用該技術(shù)來分析厭氧菌的終末代謝產(chǎn)物，已成為鑒定厭氧菌及其分類的比較可靠的方法。