臨床醫(yī)學檢驗復習資料：斑點金免疫滲濾試驗

　　臨床醫(yī)學檢驗復習資料：斑點金免疫滲濾試驗

　　斑點免疫滲濾試驗的基本原理是：以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔濾膜的可濾過性，使抗原抗體反應和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成。斑點免疫滲濾試驗最初是從斑點ELISA基礎上發(fā)展起來建立的，應用的結合物是酶標記的，稱為斑點酶免疫滲濾試驗。90年代初發(fā)展了以膠體金為標記物的斑點免疫滲濾試驗(dotymmunogoldfiltrationassay，DIGFA)，又名滴金免疫測定法(簡稱滴金法)。在滴金法中不需酶對底物的反應，更加簡便、快速，在臨床檢驗中應用日漸廣泛。

　　(一)原理

　　以雙抗體夾心法為例。在硝酸纖維素膜的膜片中央滴加純化的抗體，為膜所吸附。當滴加在膜上的標本液體滲濾過膜時，標本中含抗原被膜上抗體捕獲，其余無關蛋白等沒濾出膜片。其后加入的膠體金標記也在滲濾中與已結合在膜上的抗原相結合。因膠體金本身呈紅色，陽性反應即在膜中央顯示紅色斑點。

　　(二)試劑和操作

　　1.滲濾裝置滲濾裝置是滴金法測定中的主要試劑成分之一，由塑料小盒、吸水墊料和點加了抗原或抗體的硝酸纖維素膜片三部分組成。塑料小盒可以是多種形狀的，盒蓋的中央有一直徑約0.4～0.8cm的小圓孔，盒內墊放吸水墊料，硝酸纖維素膜片安放在正對盒蓋的中央有一直徑約0.40.8cm的小圓孔，盒的墊放吸水塑料，硝酸纖維素膜片安放在正對盒的圓孔下，緊密關閉盒蓋，使硝酸纖維素膜片貼緊吸水墊料。如此即制備成一滲濾裝置。塑料小盒的形狀最多見的是扁平的長方形小板，加之滴金法的整個反應過程都是在滲濾裝置上進行的，因此又常稱滲濾裝置為滴金法反應板。

　　2.試劑盒組成滴金法試劑盒的三個基本試劑成分是滴金法反應板、免疫金復合和洗滌液。為了提供質控保證，用于抗原測定的試劑盒還應包括抗原參照品，相應的檢測抗體的試劑盒應有陽性對照品。

　　3.測定操作以雙抗體夾心法為例，具體步驟如下：

　　(1)將反應板平放于實驗臺上，于小孔內滴加血清標本1～2滴，待完全滲入。

　　(2)于小孔內滴加免疫金復合物試劑1～2滴，待完全滲入。

　　(3)于小孔內滴加洗滌液2～3滴，待完全滲入。

　　(4)判讀結果：在膜中央有清晰的淡紅色斑點顯示者判為陽性反應;反之，則為陰性反應。斑點呈色的深淺相應地提示陽性強度。

　　(三)質量控制

　　滴金法的質量控制常采用在硝酸纖維素膜上點加質控點的方法。質控小圓點多位于反應斑點的正下方。雙抗體夾心法的質控點最好是相應抗原，若該抗原試劑不易制備或價格昂貴時，也可用SPA或針對金標抗體的抗抗體來充當。間接法的質控點采用鹽析法粗提的人IgG最為經濟、方便。

　　有將包被斑點由圓點改成短線條式的：質控斑點橫向包被成橫線條，如“-”;反應斑點縱向包被成豎線條，如“ㄏ”;兩者相交成“+”。這樣，陽性反應結果在膜上顯示紅色的正號(+)，陰性反應結果則為負號(-)，目視判斷直觀、明了。