2014年臨床執(zhí)業(yè)醫(yī)師免疫學(xué)考試輔導(dǎo)：細(xì)胞免疫功能的檢測

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　　細(xì)胞免疫(CMⅠ)是由多種細(xì)胞相互作用的結(jié)果。免疫細(xì)胞間相互作用導(dǎo)致多種細(xì)胞因子的釋放。因此細(xì)胞功能測定不僅涉及T細(xì)胞的數(shù)量和功能與包括各類因子活性測定，因此評價(jià)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能不僅程序復(fù)雜，且很難標(biāo)準(zhǔn)化

　　一、遲發(fā)型過敏反應(yīng)的體外檢測方法

　　皮膚試驗(yàn)和接觸性過敏的誘發(fā)是檢測遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)的兩種常用方法。皮膚試驗(yàn)中誘發(fā)對曾經(jīng)使病人致敏的抗原的再次應(yīng)答，而接觸性過敏是測試受者對從未接觸過的物質(zhì)發(fā)生致敏的能力。

　　1.皮膚試驗(yàn) 用皮膚試驗(yàn)診斷DTH，常用的抗原有結(jié)核菌純蛋白衍生物(PPD)、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人類試驗(yàn)時(shí)在前臂皮內(nèi)注射少量可溶性抗原，24～48小后，測量紅腫硬結(jié)的大小，硬結(jié)直徑大于10mm即被看作為陽性。表明受試者對該病原菌有了一定的細(xì)胞免疫能力，若皮試無反應(yīng)，可用更高濃度的抗原重復(fù)試驗(yàn)，若仍無反應(yīng)即為陰性，需排除皮試技術(shù)誤差，也可能受試者從未接觸過此抗原，也可能由于細(xì)胞免疫功能缺損，或由于細(xì)胞免疫功能缺損，或由于嚴(yán)重感染(麻疹、慢性播散性結(jié)核)造成的無反應(yīng)性。

　　2.接觸性過敏常應(yīng)用低分子量化合物如二硝基氯苯(DNCB)誘生接觸性過敏。化合物與皮膚蛋白質(zhì)結(jié)合而導(dǎo)至DTH反應(yīng)。在動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)，初次皮膚上涂抹DNCB后間隔7～10天再激發(fā)刺激，則皮膚出現(xiàn)即為陽性。此試驗(yàn)人類已不使用。

　　二、細(xì)胞免疫的體外檢測方法

　　體外檢測淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能，最易采集的是血標(biāo)本，首先需分離或純化淋巴細(xì)胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重為1.077的淋巴細(xì)胞分層液，當(dāng)將血液重疊于淋巴細(xì)胞分層液之上離心時(shí)，由于紅細(xì)胞(1.092)、多形核白細(xì)胞(1.090)、淋巴細(xì)胞(1.070)的比重不同而相互分開。淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞在血漿和分層液交界處形成一薄層。仔細(xì)分出這一薄層的細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞占80%，單核細(xì)胞占20%，淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞占80%，B細(xì)胞占 4%～10%，其作為非DT、非B細(xì)胞。

　　1.T細(xì)胞計(jì)數(shù)

　　(1)E花環(huán)法：人類T細(xì)胞表面有SRBC受體(CD2)能與SRBC結(jié)合形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)，將經(jīng)分層液分離現(xiàn)的RBM懸液與SRBC在含有血清的平衡鹽水中混合，經(jīng)37℃培養(yǎng)5～10分鐘放4℃過夜，取細(xì)胞懸計(jì)數(shù)，外周血淋巴細(xì)胞中約70%～80%淋巴細(xì)胞結(jié)成花環(huán)即為T細(xì)胞。目前此方法已用來分離T細(xì)胞，而不用做T細(xì)胞計(jì)數(shù)。

　　(2)用單克隆抗體計(jì)數(shù)T細(xì)胞：將人的PBM分成三等份，分別用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的單克隆抗體作第一抗體與細(xì)胞結(jié)合，再用FITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG 抗體作第二抗體進(jìn)行間接免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下或流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，在PBM中被CD3抗體染上熒光的細(xì)胞稱為CD3+細(xì)胞即總T細(xì)胞。正常人在 PBM中T細(xì)胞占70%～80%。正常人的CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞之和應(yīng)與CD3+細(xì)胞數(shù)一致。CD4+細(xì)胞與CD8+細(xì)胞的比值正常人約為2/1而艾滋病患者則比值小于1.7。

　　2.T細(xì)胞活化試驗(yàn) T細(xì)胞能被非特異的物質(zhì)稱為有絲分裂原所激活而向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。T細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程可伴隨有DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成增加，最圖導(dǎo)致細(xì)胞分裂。在光學(xué)顯微鏡下可計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化后的淋巴細(xì)胞數(shù)，也可用氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷(3HTdR)摻入正在分裂的淋巴細(xì)胞，用液閃測定儀檢查摻入正在分裂的淋巴細(xì)胞，用液測量儀檢查摻入的3H-TdR的多少確定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。最近有一種不用同位素，又可用儀器測量的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的檢查法，稱為MTT檢測法，MTT是一種甲氮唑鹽，它是細(xì)胞線粒體脫氫酶的底物，細(xì)胞內(nèi)的酶可將MTT分解產(chǎn)生藍(lán)黑色甲(fromazan)產(chǎn)物。該產(chǎn)物的多少與活性細(xì)胞數(shù)正相關(guān)。結(jié)果可用酶標(biāo)檢測儀(595mm)測量密度，做為MTT法的檢查指標(biāo)。此法的結(jié)果與3H-TdR摻入法平行，并能反應(yīng)試驗(yàn)中的活細(xì)胞數(shù)

　　3.細(xì)胞毒試驗(yàn) TC細(xì)胞、NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞、TIL細(xì)胞對其靶細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒(殺傷)作用。常用的栓測細(xì)胞毒效應(yīng)的方法是51Cr-Na2Cro4鹽水溶液與靶細(xì)胞胞混合，于37℃培養(yǎng)1小時(shí)左右，51Cr即可進(jìn)入靶細(xì)胞，與胞漿蛋白結(jié)合，洗去游離的51Cr后，即可得到51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞，將待檢細(xì)胞毒性的細(xì)胞與51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞混合(比例約為50：1或100：1)靶細(xì)胞被殺傷越多，釋放到上清液中的液游離的51Cr越多，且不能被其他細(xì)胞吸收。用γ 射線測量儀檢測上清液中的cpm值，即可計(jì)算出待檢細(xì)胞殺傷活性的高低。

　　細(xì)胞毒試驗(yàn)檢測Tc細(xì)胞效應(yīng)功能是否健全，及經(jīng)IgG介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)，或NK細(xì)胞在抗腫瘤免疫中的作用是有意義的。

　　4.混合淋巴細(xì)胞的反應(yīng)(MIR) 是體外研究T細(xì)胞的較好的方法，雙向MLR常被用來篩選骨髓移植的供體。來自不同供體的淋巴細(xì)胞分別與病人的淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)4～5天，在最后8小時(shí)摻入 51TdR摻入法測T細(xì)胞的反應(yīng)性。或用細(xì)胞毒法觀察受刺激的T細(xì)胞與活的靶細(xì)胞混合(靶細(xì)胞來自與刺激細(xì)胞相同的個(gè)體)如果T細(xì)胞受刺激后產(chǎn)生了細(xì)胞毒 T細(xì)胞，可殺死活的細(xì)胞，根據(jù)靶細(xì)胞釋放51Cr的多少算出T細(xì)胞移動(dòng)抑制因子)和LIF(白細(xì)胞移動(dòng)抑制因子)來評估細(xì)胞免疫功能。近年來應(yīng)用測定 IL-2的免疫酶技術(shù)，操作簡單，并能定量以取代了MIF和LIF的測定。單個(gè)核細(xì)胞與分裂原一起培養(yǎng)24小時(shí)，然后測定清液中的IL-2活性。在細(xì)胞免疫功能缺損時(shí)，特別是AIDS病人，IL-2分泌明顯降低。而有些疾病，如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、移植排斥反應(yīng)等病人體內(nèi)血清中IL-2水平升高，表明病人T細(xì)胞活性增高。發(fā)生移植排斥反應(yīng)的病人尿中IL-2也可升高。

　　也可用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定各種體液中活化的T細(xì)胞脫落的IL-2受體(CD25)，一般來說IL-2的水平和IL-2受體水平是平行的，IL-2和IL-2受體的檢測可用于對某些疾病的監(jiān)測，如移桿排斥、自身免疫病以及接受免疫抑制治療的病人。

　　對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞因子產(chǎn)生能力檢測是檢查細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的生物活性或抗原性?，F(xiàn)已可用核酸雜交技術(shù)，即從組織中或細(xì)胞中提取RNA，與同位素或酶標(biāo)記的該種細(xì)胞因子的cDNA探針作分子雜交試驗(yàn)，即印跡(dot blotting)或Northern印跡，若查出有某種因子的mRNA存在，即說明該細(xì)胞在所處培養(yǎng)條件下有產(chǎn)生某種細(xì)胞因子的能力。

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